ОБОГАЩЕНИЕ МУТАНТНЫМИ КЛЕТКАМИ


Обычно возникновение мутаций, даже в том случае, когда их вызывают сильными мутагенами, — относительно редкое событие. В популяциях бактерий частота мутаций может быть, например, такой низкой, как 1 мутант на 106—107 клеток.
Выделить мутант, присутствующий на обильном фоне немутировавших клеток, может оказаться нелегко, особенно если применяются непрямые методы выявления. В таких случаях перед выделением мутанта из культуры, подвергнутой действию мутагена, вводят этап обогащения.
В самой распространенной методике обогащения используется антибиотик пенициллин [11, 18]. Когда культуру, содержащую как мутанты, так и немутировавшие клетки, выращивают на искусственной среде, в которой мутантные клетки не растут, пенициллин избирательно вызывает гибель активно делящихся немутировавших бактерий, нарушая в них процесс синтеза клеточной стенки. В оптимальных условиях можно достичь 1000-кратного обогащения мутантами по отношению к немутантам.
Обогащение с помощью пенициллина
Выращивают культуру, подвергнутую предварительному действию мутагена, до ранней логарифмической фазы роста (оптическая плотность при длине волны 600 нм — около 0,1, или 15—20 ед. при 660 нм по шкале Клетта).
Добавляют 10 000 ед. пенициллина G на 1 мл среды и продолжают инкубацию культуры на качалке до тех пор, пока не прекратится увеличение мутности (обычно 60—90 мин).
Удаляют пенициллин либо фильтрованием через стерильный мембранный фильтр (например, фильтр с диаметром пор 0,45 мкм), либо инактивацией его пени- циллиназой.
Последний вариант применяют для бактерий, которые при фильтровании резко уменьшают пропускную способность фильтра. Обычно добавляют 100 ед. пенициллиназы на 1 мл и инкубируют 30 мин при температуре выращивания.
После центрифугирования при 5000 g в течение 5 мин или фильтрования (см. выше) один раз отмывают клетки свежей культуральной средой и вновь суспендируют их в ней перед проведением этапа отбора или поиска.
Показано, что помимо пенициллина эффективным пре-паратом, способствующим обогащению культуры спон-танно возникающими мутантами у различных видов рода Pseudomonas,является аминокислотный аналог — D-циклосерин [21]. При добавлении его в количестве 100 мкг/мл в сочетании с пенициллином к растущей культуре Pseudomonas putidaон вызывает селективный лизис немутировавших клеток. При этом в течение 1— 2 ч культура обогащается мутантами в 100—1000 раз. Преимущество двойной обработки перед использованием только пенициллина или только циклосерина заклю-чается в том, что в первом случае не выживают спон-танные мутанты, которые устойчивы к каждому из ан-тибиотиков по отдельности. Проведя несколько последо-вательных циклов обогащения двойной обработкой, можно увеличить относительное содержание в популя-ции мутантных клеток до значения 106 и выше и тем са-мым получить реальную возможность выделить мутант, возникающий с очень низкой частотой.
<< | >>
Источник: Ф. ГЕРХАРДТ и др.. Методы общей бактериологии: Пер. с англ.Т-2.— М.: Мир,1984. — 472 с.. 1984

Еще по теме ОБОГАЩЕНИЕ МУТАНТНЫМИ КЛЕТКАМИ:

  1. Исследование крови на клетки красной волчанки (LE-клетки)
  2. Глава 4. Клетки нервной системы- нейроглиальные клетки.
  3. 4.4. Адгезионное обогащение
  4. Часть 1. Специальные методы обогащения
  5. ЭФФЕКТЫ ОБОГАЩЕНИЯ И ОБЕДНЕНИЯ СРЕДЫ
  6. 1.3.3. Производительность радиометрического обогащения
  7. ВЫХОД, ИСТОЩЕНИЕ, ОБОГАЩЕНИЕ
  8. 1.4. Радиометрическое обогащение радиоактивных руд
  9. 1.5. Радиометрическое обогащение нерадиоактивных руд
  10. 2.6. Обогащение на жировых поверхностях
  11. 2.1. Обогащение сильвинитовых руд
  12. 2.6. Технология обогащения золота
  13. 2. Обогащение с использованием эффектов взаимодействия кусков разделяемых компонентов с рабочей поверхностью сепаратора
  14. 2.2. Обогащение по трению
  15. 2.4. Обогащение по форме
  16. 1.3. Техника выполнения радиометрического обогащения
  17. 2.3. Комбинированное обогащение по трению и упругости
  18. 14.2. Обязанность возвратить неосновательное обогащение
  19. Глава I. Иски о возврате неправомерного обогащения (кондикции)